Контроль збудливості та скорочувальної активності гладеньких м’язів (ГМ) матки забезпечує підтримання фертильності, а також здатності виношування плоду та проходження пологів. За даними ВООЗ, значна кількість випадків загибелі новонароджених у світі пов’язана саме з передчасними пологами, клітинною основою яких є порушення процесів скорочення-розслаблення міометрія.
Системи активного іонного транспорту плазматичної мембрани та внутрішньоклітинних кальцієвих депо виконують роль важливого регулятора функціонування ГМ матки. Зокрема, варто виділити системи активного транспорту іонів Са2+: кальцієві помпи плазматичної мембрани (ПМ) і саркоплазматичного ретикулуму, Na+/Са2+-обмінник ПМ, Са2+-транспортуючі системи мітохондрій), які обумовлюють підтримання базального рівня (близько 100 нМ) внутрішньоклітинної концентрації цього катіона, а також забезпечують термінацію процесів збудження [1,2].
Кальцієва помпа плазматичної мембрани (РМСА) – конститутивна структура ПМ клітин, яка виконує функцію високоафінної (КМ для Са2+ становить 0,2-0,5 мкМ) системи по виведенню іонів Са2+ з цитоплазми, забезпечуючи тривале підтримання базальної концентрації цих катіонів у стані спокою. РМСА належить до родини іон-транспортних АТФ-аз Р-типу (підклас Р2В). Стехіометрія транспортованих іонів Са2+ та гідролізованих при цьому молекул АТФ складає 1:1. Ідентифіковано 4 ізоформи РМСА (1-4), які кодуються різними генами; додаткове різноманіття (понад 20) ізоформ забезпечується альтернативним сплайсингом [3].
Здійснюючи викачування Са2+ з гладеньком’язових клітин (ГМК), РМСА залучена до підтримки внутрішньоклітинної концентрації цих катіонів, причому внесок цієї кальцій-транспортуючої системи у підтримання базальної внутрішньоклітинної концентрації Са2+ в клітинах міометрія становить 70% (інші 30% забезпечує Na+/Са2+-обмінник) [4].
Дослідженнями останніх років встановлено, що окремі сполуки, що належать до класу каліксаренів, мають здатність вибірково інгібувати Са2+, Mg2+-АТРазу ПМ; зокрема, калікс[4]арен з кодом С-90 діє на цю систему з І0,5=34,6±6,4 мкМ [2, 5]. Також попередньо нами встановлена здатність цього калікс[4]арену у концентрації 10 мкМ NO-залежним шляхом пригнічувати скорочувальну активність та уповільнювати розслаблення ГМ міометрія, суттєво зменшуючи нормовану максимальну швидкість фази релаксації [6].
Метою даної роботи було дослідити механокінетичні закономірності впливу кумулятивного підвищення концентрації калікс[4]арену С-90 (10 нМ – 100 мкМ) на спонтанну скорочувальну активність міометрія щурів.
Матеріали і методи
Експерименти проводили на щурах лінії Wistar (середня вага тварин становила 200-250 г). Тензометричні досліди проводили на препаратах поздовжніх гладеньких м’язів рогів матки. Скоротливу активність досліджували в ізометричному режимі за допомогою датчика сили. Сигнали реєстрували, використовуючи аналого-цифровий перетворювач.
В дослідах використовували розчин Кребса (мМ): 120,4 NaCl; 5,9 KCl; 15,5 NaHCO3; 1,2 NaH2PO4; 1,2 MgCl2; 2,5 CaCl2; 11,5 глюкоза; рН розчину становив 7,4.
Калікс[4]арен С-90 був синтезований під керівництвом та за участі академіка НАНУ В.І. Кальченка у відділі хімії фосфоранів Інституту органічної хімії НАН України.
Про ефективність скорочувальної діяльності м’язів судили за тривалістю скорочень, пауз між ними, тривалістю окремих фрагментів скорочень (фаз скорочення і розслаблення), коефіцієнтом асиметрії (відношення тривалості фази скорочення до тривалості фази розслаблення), скоротливим циклом (тривалість поодинокого скорочення та паузи після нього), індексом активності скорочень (відношення тривалості скорочень до тривалості пауз між ними) [7]. Фазою скорочення вважали фрагмент скоротливої відповіді від початку зміни сили до її максимального значення (амплітуди фазного скорочення). Фаза розслаблення починалась від максимуму фазного скорочення і тривала до повернення сили на базальний рівень. Також визначали середню швидкість наростання скорочення (Fmax/t) – відношення амплітуди скорочення до часу її досягнення). Для кількісного визначення змін ефективності сумарної скорочувальної активності препаратів ГМ використовували показники скоротливих індексів в одиницях Монтевідео (МU, добуток середньої амплітуди та кількості скорочень за 10 хв) та Олександрійських одиницях (АU, добуток MU та середньої тривалості скорочень за 10 хв) [7].
Також повний профіль спонтанних циклів скорочення-розслаблення досліджували за допомогою розробленого нами емпіричного багатопараметричного методу комплексного механокінетичного аналізу (із розрахунком часових (τ0, τC і τR), силових (Fmax, FC та FR), швидкісних (VC і VR), а також імпульсних параметрів (Іmax, ІC та ІR) [8].
З метою додаткового аналізу кінетичних закономірностей окремих спонтанних скорочень, їх аналізували відповідно до методу розрахунку нормованої на амплітуду (Fmax) максимальної швидкості фази розслаблення (Vnr) [9].
Дані обробляли методами варіаційної статистики із використанням програми Origin 2018. Для визначення вірогідних відмінностей між середніми величинами вибірок однофакторний дисперсійний аналіз; апостеріорне порівняння здійснювали з використанням тесту Бонферроні. У всіх випадках достовірними вважали результати за умови значення ймовірності р, менше 5% (р < 0.05). Аналіз достовірності апроксимації даних лінійною функцією здійснювали із використанням F-критерію Фішера; коефіцієнти детермінації (R2) були не нижчими за 0,9. Результати представлені як середнє арифметичне ± стандартна похибка середнього, n – кількість дослідів.
Результати та обговорення
Кумулятивне підвищення в омиваючому розчині концентрації калікс[4]арену С-90 від 10 нМ до 100 мкМ супроводжувалось дозо-залежним пригніченням спонтанної скоротливої активності препаратів міометрія. Перш за все, це відображалось у зниженні амплітуди та частоти скорочень, достовірні зміни яких спостерігались у присутності високих концентрацій С-90 (10 та 100 мкМ). Зниження частоти скорочень обумовлювалось збільшенням тривалості маткового циклу, яка у випадку концентрацій С-90 у діапазоні 100 нМ – 10 мкМ у середньому складала 120%, а при дії 100 мкМ зростала до 133% порівняно з контролем (Рис.1).
Чутливим до дії каліксарену виявився показник індексу скоротливої активності м’язових препаратів, достовірні дозо-залежні зміни якого мали місце на усьому діапазоні досліджених концентрацій С-90. Так, за присутності калікс[4]арену С-90 у концентрації 100 мкМ цей параметр знижувався у середньому на 60% щодо контролю. Також у присутності калікс[4]арену С-90 спостерігалось значне дозо-залежне збільшення тривалості інтервалів між окремими скороченнями, причому достовірні зміни мали місце на усьому діапазоні концентрацій С-90, досягаючи 202% за дії максимальної використаної концентрації цієї сполуки.
Хоча в умовах преінкубації гладеньких м’язів матки з калікс[4]ареном С-90 не змінювалась тривалість окремих спонтанних скорочень, його високі концентрації спричиняли зміну структури скоротливого акту. Так, мало місце збільшення тривалості фази скорочення, тоді як абсолютні значення тривалості фази розслаблення не зазнавали статистично значущих змін. За цих умов калікс[4]арен С-90 (100 мкМ) викликав підвищення показника асиметрії скоротливого акту (в середньому до 132% порівняно з контрольними скороченнями).
Рис. 1. Параметри спонтанної скорочувальної активності міометрія щурів за кумулятивного збільшення концентрації (10 нМ – 100 мкМ) калікс[4]арену С-90: частота, матковий цикл, тривалість скоротливого акту, інтервал між скороченнями, індекс скоротливої активності. За 100% прийнято відповідні показники спонтанної активності в контролі (n=6, * - p<0.05 – різниця достовірна щодо контролю).
Збільшення тривалості фази скорочення з одночасним зниженням амплітуди скорочення призвело до зменшення показника середньої швидкості наростання скорочення (Fmax/t), який, зокрема, за присутності калікс[4]арену С-90 у концентрації 100 мкМ становив у середньому 66% щодо контролю. Про аналогічні ефекти свідчить суттєве зростання параметрів: характеристичного часу фази скорочення (τC) та максимальної видкості скорочення (VC), які спостерігались за дії С-90 у діапазоні концентрацій 1 – 100 мкМ (Рис. 2А)
Рис. 2 Параметри спонтанної скорочувальної активності міометрія щурів за умови кумулятивного збільшення концентрації (10 нМ – 100 мкМ) калікс[4]арену С-90: А – часові параметри (τ0, τC і τR); Б – силові параметри (Fmax, FC та FR); В – імпульсні параметри (Іmax, ІC та ІR); Г – швидкісні параметри (VC і VR). За 100% прийнято відповідні показники спонтанної активності в контролі (n=6, * - p<0.05 – різниця достовірна щодо контролю).
Також із застосуванням багатопараметричного методу комплексного механокінетичного аналізу нами було встановлено, що сполука С-90 на усьому діапазоні досліджених концентрацій суттєво зменшує показники силових параметрів (Fmax, FC та FR), а також значення імпульсів сили Іmax, IC та IR спонтанних скорочень міометрія (Рис. 2 Б і В).
Оскільки попередньо біохімічними дослідженнями було переконливо доведено, що калікс[4]арен С-90 має вибіркову дію на системи первинного активного транспорту Са2+ у ГМК матки (пер за все, за рахунок пригнічення ПМКА), наші подальші дослідження стосувались механокінетичного аналізу процесів розслаблення спонтанних фазних скорочень препаратів міометрія.
Варто відзначити, що на тлі дії усіх застосованих концентрацій калікс[4]арен С-90 спричиняв уповільнення релаксації спонтанних скорочень м’язових препаратів матки щурів, що відобразилось у достовірному зниженні параметра максимальної швидкості фази розслаблення (VR) (Рис. 2 Г). Оскільки цей параметр опосередковано чутливий до амплітуди скорочень, надалі ми визначали за методом [9] показник нормованої максимальної швидкості фази розслаблення (Vnr). Встановлено, що достовірне зниження Vnr спостерігалось при дії високих концентрацій (10-5 та 10-4 М) калікс[4]арену С-90.
Процес розслаблення вісцеральних ГМ супроводжується зниженням внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+ у міоплазмі [10]. Тож отримані нами результати дослідження закономірностей функціонування міометрія в умовах кумулятивної дії (діапазон концентрацій 10 нМ – 100 мкМ) калікс[4]арену С-90 вказують на те, що ця сполука гальмує процеси екструзії Са2+ з міоплазми ГМК, ймовірно, діючи безпосередньо на молекули ПМКА. Варто відзначити, що С-90 також, ймовірно, пригнічує процеси надходження цих катіонів до ГМК з позаклітинного середовища, спричиняючи зниження швидкості наростання сили під час фази скорочення, а також зменшуючи частоту і силу спонтанних скорочень міометрія.
Література:
1.Pehlivanoğlu B, Bayrak S, Doğan M. A close look at the contraction and relaxation of the myometrium; the role of calcium. J Turk Ger Gynecol Assoc. 2013 Dec 1;14(4):230-4. doi: 10.5152/jtgga.2013.67763.
2.Mazur II, Veklich TO, Shkrabak OA et al. Selective inhibition of smooth muscle plasma membrane transport Са2+,Mg2+-АТРase by calixarene C-90 and its activation by IPT-35 compound. Gen Physiol Biophys. 2018 Mar;37(2):223-231.
3.Lopreiato R., Giacomello M., Carafoli E. The Plasma Membrane Calcium Pump: New Ways to Look at an Old Enzyme // J. BIOL. CHEM. 2014; 289 (15): 10261–10268.
4.Matthew A, Shmygol A, Wray S. Ca2+ entry, efflux and release in smooth muscle. Biol Res. 2004;37(4):617-24.
5.Veklich TO. The inhibitory influence of calix[4]Arene of C-90 on the activity of Ca2+,Mg2+-ATPases in plasma membrane and sarcoplasmic reticulum in myometrium cells. Ukr Biochem J. 2016 Mar-Apr;88(2):5-15.
6.Цимбалюк О.В., Костерін С.О. Вплив каліксарену С-90 на скоротливу активність гладеньких м’язів міометрія щурів // Біологічні Студії: 2013; 7 (3) 5-20.
7.AWHONN, (2005) Fetal Heart Monitoring Principles & Practices, KENDALL HUNT PUBLISHING COMPANY 3rd Ed. 98-102.
8.S. Kosterin, O. Tsymbalyuk, O. Holden Multiparameter analysis of mechanokinetics of the contractile response of smooth muscles. Series on Biomechanics, Vol.35 No.1 (2021),14-30
9.BurdygaTh.V., Kosterin S.A. Kinetic analysis of smooth muscle relaxation. Gen. Physiol. Biophys, 1991; 10: 589–598.
10.Testrow CP, Holden AV, Shmygol A, Zhang H. A computational model of excitation and contraction in uterine myocytes from the pregnant rat. Sci Rep. 2018 Jun 14;8(1):9159. doi: 10.1038/s41598-018-27069-x.
|
![:: ECONOMY :: МОДУЛЯЦІЯ МЕХАНОКІНЕТИКИ СПОНТАННИХ СКОРОЧЕНЬ МІОМЕТРІЯ ЩУРІВ ІНГІБІТОРОМ КАЛЬЦІЄВОЇ ПОМПИ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ КАЛІКС[4]АРЕНОМ С-90](/images/site_01_new.jpg)
![:: ECONOMY :: МОДУЛЯЦІЯ МЕХАНОКІНЕТИКИ СПОНТАННИХ СКОРОЧЕНЬ МІОМЕТРІЯ ЩУРІВ ІНГІБІТОРОМ КАЛЬЦІЄВОЇ ПОМПИ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ КАЛІКС[4]АРЕНОМ С-90](/images/site_02_new.jpg)
![:: ECONOMY :: МОДУЛЯЦІЯ МЕХАНОКІНЕТИКИ СПОНТАННИХ СКОРОЧЕНЬ МІОМЕТРІЯ ЩУРІВ ІНГІБІТОРОМ КАЛЬЦІЄВОЇ ПОМПИ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ КАЛІКС[4]АРЕНОМ С-90](/images/site_03_new.jpg){kind=small}
Голосування 
Ця робота ліцензується відповідно до Creative Commons Attribution 4.0 International License
Знайшли помилку? Виділіть помилковий текст мишкою і натисніть Ctrl + Enter